荧光定量PCR技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,随着 PCR 反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,结合相应的软件可以对产物进行分析,从而得到一条荧光扩增曲线,计算待测样品的初始模版。实时荧光定量PCR技术是一次由DNA定量技术的飞跃。运用该项技术,我们可以对DNA 、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。主要通过两种方式:
1. SYBR Green I
SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料,SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号(图1),荧光信号与双链DNA分子数成正比,随着扩增产物增加而增加,荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量。
2. TaqMan 探针
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累,因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系(图2),从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
服务项目:
1. 定性分析
病毒和病原菌定性检测、生物品种定性鉴定。
2. 绝对定量
病毒载量和病原菌精确分析、导入基因拷贝数解析、GMO精确解析、mRNA表达量精确分析。
3. 相对定量
基因芯片结果验证、miRNA表达量分析、siRNA效果验证。采用2-ΔΔ Ct法
进行计算。
4. SNP(单核苷酸多态性)检测
服务流程:
根据目的基因设计及合成引物、TaqMan探针
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DNA提取 RNA的提取
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逆转录
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使用荧光染料SYBR Green TaqMan探针法进行实时定量PCR
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数据处理,向客户提交数据分析结果及书面报告。
客户提供:
组织、细胞、血液等样品材料,纯化好的总RNA或总DNA。
公司提供:
实时定量PCR的原始数据、数据分析结果及书面报告。