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Small RNA Seq

Small RNA Seq

小RNA是存在于生物体内的一类高度保守的RNA,序列的长度一般在18-32nt之间,小RNA包括了微小RNA(microRNA, miRNA),小干扰RNA(siRNA),核仁小RNA(snoRNA)和能与piwi蛋白互作的piRNA等。它们是各类生物生命活动中重要的调控因子,其作用与功能被研究的较为透彻,小RNA们可参与基因的表达调控,转录后调控,RNA的加工与剪切,疾病发生发展及个体发育调控等重要的生物学过程。

小RNA的测序采用高通量技术及胶分离技术,对于样本中所有的特定长度的小RNA片段进行测序和表达定量,一次性可以获得数百万条小RNA的序列信息,并依托后续强大的生物信息分析平台,可以实现小RNA的各类信息分析,鉴定已知或探索未知小RNA与其靶作用基因以及解析各类小RNA之间或与mRNA的互作关系等。

技术路线



技术优势

测序策略

测序策略:
SE50
建议数据量:

一般测序:10M reads

深度测序:20M reads

收样要求

组织
500mg新鲜植物样本,300mg新鲜动物样本   注: 肿瘤组织优先选择RNAlater保存
细胞
>5*106 悬浮/贴壁细胞
血液
>3ml 全血/全血分离的有核细胞
RNA总量
>3 μg,浓度 >50ng/μl, RIN值>9
外泌体
>5ml 全血分离的血浆/血清外泌体或>20ml 其他体液及细胞培养上清液分离的外泌体
对于较难进行取材的医学类样品,可以适当降低样本标准。

您可以得到的数据分析

Small RNA Seq生物信息学分析流程

常规分析
级分析

测序数据质控分析

高质量序列与miRNA数据库比对

RNA分类及注释(miRNA, siRNA,piRNA, rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, repeat asscociated sRNA)

预测新的miRNA

miRNA靶基因预测

靶基因功能注释、GO富集分析和代谢通路富集分析

miRNA表达谱分析

样本间miRNA表达差异分析(有重复样本)

mRNA进行关联分析(需有mRNA数据)

个性化定制分析

案例解析

利用小测序研究miRNAs与弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)病人存活率的关系


弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是成人淋巴瘤中的一种常见恶性肿瘤,其手术后死亡率高达30-40%左右。本研究利用小RNA测序的方法探究与DLBCL相关的miRNA信息。通过测序 92DLBCL患者的肿瘤样本和15例良性细胞样本,并设置140例福尔马林处理过的或石蜡包埋的样本用来对结果进行验证,共鉴定出了25个已知或未知的与DLBCL患者存活率显著相关的miRNAs,这些miRNAs具有作为治疗效果衡量分子指标的潜力。进一步分析,其中4个高表达的miRNAs与疗良好的病人显著相关,2个高表达的miRNA疗效不好的患者的生存指数密切相关。 miRNA聚类分析显示不同疗效病人具有不同的miRNA表达谱和表达强度,且 DLBCL患者中miRNA的表达有其自有的模式。最后,本研究利用所得数据对比发表的转录组数据,进行了miRNA与调控靶标的综合分析,最终鉴定出一个可参与组蛋白修饰的新颖miRNA,其具备衡量DLBCL患者治疗效果的潜力。


Lim, Emilia L., et al. "Comprehensive miRNA sequence analysis reveals survival differences in diffuse large B-cell lymphoma patients." Genome biology 16.1 (2015): 18. (Impact factor: 11.908)


A. 小RNA测序后得出的不同种类小RNA序列数量(包括miRNAtRNAsnRNArRNA等)

B. DLBCL病人样本与良性细胞中显著差异表达的miRNAs(红点代表差异表达的基因)

C. DLBCL样品中显著差异表达的miRNA GO功能高集预测图(纵列为GO功能,横条为基因名称,上方红条代表上调miRNAs,绿条代表上调miRNAs ,灰色方块代表显著富集)


RNA测序鉴定紫云英属的chrysochlorus对硒胁迫代谢反应中起重要作用的miRNA


硒在维持人体健康和环境的可持续发展中都发挥着重要的作用,能够大量储备硒的植物目前被认为是获取硒的新资源。紫云英属的植物可以把硒转化为非氨基酸化合物,miRNA在此类代谢中发挥着重要的作用,但其作用机制却不清晰。本研究利用小RNA测序技术,鉴定出了418个已知的microRNA(属于380miRNA家族)和150个未知的microRNA,其中71种家族的miRNA只特异性的表达在用硒处理过的样品中。通过后续生物信息学分析,3miRNA在硒处理后的样品中表达量上升,2miRNA表达量降低。通过GO富集和KEGG通路分析后得出,这些miRNA参与多项分子功能和生物代谢。研究最后通过降解组测序与数据整合,得出8种特定的miRNA参与硒刺激反应和相关代谢。


Cakir, Ozgur, Bilgin Candar‐Cakir, and Baohong Zhang. "Small RNA and degradome sequencing reveals important microRNA function in Astragalus chrysochlorus response to selenium stimuli." Plant biotechnology journal (2016): 543-556. (Impact factor: 7.443)



A. 硒处理过的样本与对照组样本在测序后差异表达与共同表达的miRNA

B. 硒处理过样本与对照组中特异表达的miRNA散点图(红点为对照组特异表达miRNAs,绿点为硒处理后样本特异表达miRNAs

研究趋势与研究热点

  研究现状:

1.  miRNA的形成和作用机制已了解的比较清晰,但是仍有一些比较新的点值得研究;

2.  更多的研究把small RNA作为一种分子间相互作用研究的桥梁和工具,用其与其他组学组合来研究生物体内各类作用;

3.  piRNA可以与piwi蛋白相互作用,其在生殖发育中的作用是目前一个研究热点,具备开发成为新药的可能性。


  新颖观点及趋势:

1.  外泌体miRNAs 作用研究;

2.  单一miRNA与常见疾病关系的研究已经较为成熟,而多条miRNA组成的miRNA簇与疾病的关系是研究的热点;

3.  miRNA自身启动子的甲基化联系研究,顺应了RNA甲基化研究的趋势;

4.  miRNA从细胞核内转录,与相关蛋白转录定位的研究,此过程可能影响miRNA表达水平

客户常见问题


small RNA测序后的数据包括了哪些种类的RNA

测序后的数据包括了miRNAtRNApiRNAsnoRNA等类型的RNA。在实际测序后,约有三分之二左右的数据是可以比对到数据库上的已知miRNA,其余的包括了上述其他类型的RNA和未知的miRNA。这种测序方式之所以被称为小RNA,主要是因为除了可以检测出除了miRNA以外,还包括其他种类的小RNA



small RNA在建库是使用的方法是?

在总RNA提取之后, 根据small RNA片段小,且其3’端有自由的羟基基团,5‘端有自由的磷酸基团的特点,可直接在small RNA的两端加上接头,然后逆转录成cDNA。在逆转录后,一般使用跑胶分离方法选择性地回收小片段的small RNA再进行测序。



small RNA测序需要合作伙伴提供已知序列吗?可以对于无参考基因组的物种进行测序吗?

当测序物种非模式生物时,合作伙伴应适当提供待测物种的参考基因组全序列与预测用的靶基因序列,以便于在进行测序结果比对,分析和预测等。对于无参考基因组的物种,也可以开展small RNA测序研究,可用相近物种的基因全序列或者待测物种的EST序列作为参考基因序列,对于无近缘物种的待测物种测序来说,我们可以先做出无参转录组的拼接,后用其作为参考序列就进行small RNA的分析。