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环状RNA测序

环状RNA测序

环状RNA(CircRNA),是相对于其他非编码RNA发现较晚的一类环状的、不具备或少具备编码能力的RNA,其广泛的存在于真核细胞的转录组中。环状RNA通常是在mRNA前体的可变剪切过程中,由上游外显子的5’端与下游外显子的3’端进行反向剪切而形成的。


大量内源的环状RNA存在于高等动物当中,它们在物种中保守,对RNA酶不敏感,通常呈现组织和发展时期的表达特异性。已知环状RNA具备重要的调控功能,其中包括可以充当分子海绵(ceRNA)与mRNA竞争结合miRNAs,调控转录剪切和其他类型RNA以及蛋白质活性等。最新的研究显示环状RNA在动脉粥状硬化血管疾病、神经退行性疾病和多种癌症等多种疾病中扮演重要的角色。近年来,环状RNA已经成为了研究热点,有望成为疾病诊断的检测标志物和靶向治疗靶点,研究意义重大。

技术路线

技术优势

测序策略

测序策略:
PE150
建议数据量:

10G 以上

收样要求

组织
500mg新鲜植物样本,300mg新鲜动物样本注: 肿瘤组织优先选择RNAlater保存
细胞
>5*106悬浮/贴壁细胞
血液
>3ml全血/全血分离的有核细胞
RNA总量
>3μg,浓度 >50ng/μl, RIN值>6.5
对于较难进行取材的医学类样品,可以适当降低样本标准。

您可以得到的数据分析

环状RNA测序生物信息学分析流程

常规分析
高级分析

测序数控质控分析

高质量序列与数据库比对

反向剪切位点定位

CircRNA鉴定与注释

全长环形转录本重建

CircRNA来源基因分析

CircRNA表达水平分析

鉴定新的circRNA

可变剪切事件识别

样本间差异circRNA表达分析及筛选

环状RNA来源基因的GO和KEGG富集分析

CircRNA-miRNA互作分析

个性化定制分析

案例解析

来源于编码神经突触基因的circRNAs可调控突触的形成


本研究对小鼠的五个不同组织(脑,心脏,肝,肺,睾丸)中的环状RNA进行了深度测序,鉴定出共13,011个环状RNA,通过GO富集分析与来源分析,揭示了环状RNA在脑部的富集量最多,且来源基因编码的蛋白与突触形成及相关功能有关。并进一步对不同时期的小鼠海马体进行测序分析,得知P10期是环状RNA表达差异最大的时期,证实了环状RNA在神经突触形成过程中起到关键调控作用。后续实验通过结合各类方法,本研究揭示了许多环状RNA在不同的突触生成时期会改变其表达丰度,呈现表达量持续升高或者下降的趋势,说明环状RNA可能在神经系统的发育过程中发挥作用。


You, Xintian, et al. "Neural circular RNAs are derived from synaptic genes and regulated by development and plasticity."Nature neuroscience18.4 (2015): 603-610.(Impact factor: 17.839)


A.小鼠体细胞和神经细胞中circRNAs的表达情况(红点代表环状RNA,灰点代表编码RNA),环状RNA显著富集在神经细胞样品中

B.不同时期的小鼠海马体中环状RNA的表达热图,E18、P1、P10和P30代表了胚胎及出生后不同天数。P10时期的环状RNA表达量差异性最大


鉴定circRNAs的内部结构和选择性剪切事件和多重种子比对法


CircRNA的可变剪切形式多样,内部结构也很多变。中国科学院赵方庆团队结合长读段测序分析和实验验证,基于常规环状RNA接合位点BSJ(back-spliced junction read pairs)识别的方法,进一步探索了10种人类细胞系以及62种果蝇不同组织和发育时期样品中环状RNA多变的内部结构特征,精确识别了环状RNA外显子结构和可变剪接事件。此外,该研究结果还显示了可变剪接事件在环状RNA内部普遍存在,在定位上具有明显的核内倾向,同时还表现出组织和发育阶段特异的表达模式。基于此研究开发的CIRI平台改善了之前过于依赖已有数据库信息的环状RNA测序后分析方法,在BSJ位点识别的基础上,进行了从头拼接与分析,保证了在相同的测序环境下,CIRI可以检测到更多的环状RNA。

随后,团队又提出了基于最大似然法的多重种子匹配的方法,这种方法可以把BSJ上下游基因序列切割成为小片段,对测序结果进行比对分析,解决了之前进行大片段比对时可能出现的结合位点前后基因重复的情况,降低了错误检出率,进一步的提高了环状RNA的识别率和检出率。上述研究为环状RNA形成机制,功能研究和生物信息学分析提供了新的方法与新的角度。


Gao, Yuan, et al. "Comprehensive identification of internal structure and alternative splicing events in circular RNAs."Nature communications(2016).(Impact factor: 12.124)

Gao, Yuan, Jinyang Zhang, and Fangqing Zhao. "Circular RNA identification based on multiple seed matching."Briefings in Bioinformatics(2017): bbx014.(Impact factor: 5.134)


A. 不同的circRNA剪切路线和circRNA外显子mapping图,揭示了环状RNA内部结构会由于不同的可变剪切方式呈现多样性

B.多重种子比对法示意图,在反向剪切位点上下游选择序列,处理成小片段“种子”进行比对

研究趋势与研究热点

研究现状:
1.环状RNA产生机制的研究;
2.环状RNA与DNA,RNA和蛋白质之间的相关作用的研究;
3.环状RNA与疾病相关的研究,可作为疾病的生物标志物;
4.环状RNA在不同样本和不同情况之间的表达谱构建与分析;

研究前沿趋势:
1.环状RNA作为分子海绵吸附miRNA,虽然已经有很多文章发表,此方向依然是主流;
2.跳出ceRNA机制,从环状RNA与蛋白或者DNA结合研究下游功能;
3.围绕环状RNA的产生或者上游展开,例如与mRNA竞争转录;
4.研究“非编码” 环状RNA的开环及蛋白翻译功能等。

客户常见问题

CircRNA测序建库时的去线性RNA的作用是什么?
原核生物的基因为多顺反子结构,如果不加区分反义转录本上的基因,其对应位置的基因表达量会计算不准确,操纵子及基因结构的预测也随之不准确。
CircRNA的结构是环形的,与线性的lncRNA不同,不具备自由的5’端和3’端。虽然利用lncRNA的去核糖体建库方法也可以得到环状RNA的信息并对其进行分析,但是此类环状RNA一般是丰度较高且表达量高的,数据结果可能并不能很好的呼应实验设想。而根据circRNA的结构特征,采用先去除核糖体RNA再用RNase R去除线性RNA的建库方法,可以尽可能多、全的富集到样品中circRNAs,并在后续的生物信息学分析得到更多的数据。

在进行完circRNA测序后,可以进行哪些后期的验证工作?
做完circRNA测序后,对于表达丰度高、具备差异、新颖性高等具备研究价值的已知或新鉴定出来的circRNAs可以在本公司的荧光定量PCR(qRT-PCR)平台上进行检测验证。由于circRNA的结构特殊,因此我们采用特殊设计的引物对目标circRNAs进行定量或定性分析,结果精确可靠。

circRNA测序技术与芯片技术相比,各有什么优缺点?
芯片相对于测序技术,操作较为简便,费用较低且数据产出时间较快,可以对已知的circRNAs快速准确的进行分析。但是测序技术可以同时检测已知和鉴定新的circRNAs,得到的数据更加全面并精确到单碱基的分辨率上。除此之外,可以避免使用芯片技术时产生的较大的检测噪音。

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